Identification of insect-specific flaviviruses in areas of Brazil and Paraguay experiencing endemic arbovirus transmission and the description of a novel flavivirus infecting Sabethes belisarioi.

Viral infection was examined with pan-flavivirus and pan-alphavirus sets of primers in mosquitoes collected in four South American regions with confirmed pathogenic arbovirus circulation. Positive pools for flavivirus infection were sequenced and screened for specific arboviruses, which were not detected. However, NS5 gene sequencing showed that most sequences corresponded to the insect-specific Culex flavivirus. One sequence retrieved from an Aedes albopictus pool grouped with the insect-specific Aedes flavivirus and two Sabethes belisarioi pools were infected by a previously unknown flavivirus, tentatively named Sabethes flavivirus (SbFV). Phylogenetic inference placed SbFV as ancestral to a clade formed by Culiseta flavivirus, Mercadeo, and Calbertado. SbFV polyprotein showed an average aminoacidic identity of 51% in comparison to these flaviviruses. In vitro studies suggest that SbFV infects insect cells, but not vertebrate cells, therefore, we propose it as a new insect-specific flavivirus. These results highlight the wide distribution of insect-specific flaviviruses concomitant with the circulation of emergent arboviruses.

Estandarización de una técnica de RT-PCR anidada para detección de alfavirus / Standardization of a nested RT-PCR technique for alphavirus detection

El género Alphavirus está constituido por virus de ARN de los cuales, varias especies son causantes de enfermedades humanas y animales como los virus chikungunya, Mayaro y los virus de encefalitis equinas, por lo que son considerados un problema de salud pública a nivel regional. En Paraguay han sido reportadas infecciones humanas por chikungunya pero son necesarios más estudios para ampliar conocimientos sobre circulación y ecoepidemiología de los alfavirus. La transcripción reversa de ARN seguida de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) anidada es de gran utilidad como herramienta diagnóstica y en la vigilancia epidemiológica. El objetivo de este estudio fue definir las condiciones óptimas de reacción y determinar el límite de detección para una RT-PCR anidada para la detección genérica de alfavirus. El límite de detección obtenido, de 0,47 UFP/mL, indica una alta sensibilidad, pudiéndose aplicar la técnica a muestras humanas y animales de suero, líquido cefalorraquídeo, órganos y a pooles de mosquitos. Este trabajo servirá de base a otros estudios de detección e identificación de especies de alfavirus circulantes en nuestro país, lo que contribuiría a fortalecer su vigilancia y prevención.

The genus Alphavirus consists of RNA viruses of which several species areresponsible for human and animal diseases, such as chikungunya, Mayaro and equineencephalitis viruses, and are therefore considered a regional public health problem. InParaguay, human infections have been reported by chikungunya, but more studies areneeded to increase knowledge on the circulation and ecoepidemiology of alphaviruses.Reverse RNA transcription followed by a nested polymerase chain reaction (RT-PCR) isvery useful as a diagnostic tool and in epidemiological surveillance. The objective ofthis study was to define optimal reaction conditions and to determine the limit ofdetection for a nested RT-PCR for generic alphavirus detection. The detection limitobtained, of 0,47 PFU/mL, indicate high sensitivity, and the possibility of applying thetechnique to human and animals samples of serum, cerebrospinal fluid, organs andmosquito pools. This work will serve as a basis for other studies of detection andidentification of alphavirus species circulating in our country, which would helpstrengthen the surveillance and prevention.

Búsqueda de flavivirus en individuos con sospecha clínica de dengue y resultado negativo para el antígeno NS1 en Paraguay / Search of flavivirus in individuals with clinical suspicion of dengue and negative for the NS1 antigen in Paraguay

Los flavivirus son responsables de una considerable morbi-mortalidad a nivel mundial. Entre ellos, el virus del dengue (DENV) es causante de graves problemas de salud pública en Paraguay. El objetivo del estudio fue detectar infecciones por flavivirus a través de una reacción de RT-nested PCR genérica para flavivirus en 195 muestras de individuos con sospecha de dengue, negativos por el test inmunocromatográfico (antígeno NS1 ­ DENV), provenientes del área metropolitana de Asunción entre 2011 y 2013. Las muestras positivas para flavivirus fueron sometidas a dos reacciones de RT-nested PCRs específicas para DENV. El límite de detección (LD) para flavivirus fue de 0,2 UFP/reacción. En total 43/195 muestras fueron positivas para flavivirus. De estas, 38/43 (88,4%) correspondieron a DENV (6 DENV-1, 30 DENV-2 y 2 DENV-3). Además, 5/43 casos (11,6%) positivos para flavivirus fueron negativos para DENV por ambas reacciones específicas, pudiendo deberse a infecciones por otros flavivirus. Los resultados sugieren que la utilización de una reacción genérica seguida de otras reacciones específicas para DENV en casos febriles negativos para NS1 por el método inmunocromatográfico permitiría detectar más casos de infecciones por DENV y además, podría contribuir a la identificación de casos debido a infecciones por otros flavivirus.

Flaviviruses are responsible for considerable worldwide morbidity and mortality. Among them, the dengue virus (DENV) causes serious public health problems in Paraguay. The objective of the study was to detect flavivirus infections using a generic RT-nested -PCR in 195 samples of individuals with suspected dengue and negative for the inmunochromatographic test (NS1 antigen ­ DENV), from the metropolitan area of Asuncion between 2011 and 2013. The flavivirus-positive samples were subjected to two reactions of DENV-specific RT-nested PCRs. The detection limit (DL) for flavivirus was 0.2 PFU / reaction. In total, 43/195 samples were positive for flavivirus. Of them, 38/43 (88,4%) corresponded to DENV (6 DENV-1, 30 DENV-2 and 2 DENV-3). In addition, 5/43 cases (11.6%) positive for flavivirus were negative for DENV by both specific reactions, and may be infections caused by other flaviviruses. The results suggest that the use of a generic reaction followed by other DENV specific reactions in febrile negative cases for NS1 by the immunochromatographic method would allow the detection of more cases of DENV infections and could contribute to the identification of cases due to infections by others flaviviruses.